Cell | 深度解析陆生植物叶绿体蛋白输入系统的奥秘
加星标，再也不怕错过更新！方法见文末动图。
叶绿体是植物细胞进行光合作用的主要场所，其正常运作依赖约3000种蛋白质，而大多数蛋白质由核基因编码，以非活性前体蛋白形式借助叶绿体膜上的TOC-TIC转入系统进入基质内。整个运输过程需要水解ATP提供能量，目前学界对能量产生机制有两种观点：一是叶绿体基质内的三种分子伴侣（Hsp93、cpHsp70和Hsp90C）发挥ATPase功能；二是涉及分子量高达2MD的异六聚体转入马达Ycf2-FtsHi。
有研究表明，在前体蛋白存在的情况下，Ycf2-FtsHi和TIC会形成一个中间体超复合物，但目前缺乏这种超复合物存在的直接结构证据，且这两个复合物之间直接关联的潜在机制仍不清楚。
为进一步揭示叶绿体蛋白转入系统的工作模式，2024年8月27日，西湖大学闫浈课题组在《细胞》杂志发表了“Structural insights into the chloroplast protein import in land plants”的研究文章。研究人员纯化解析了拟南芥Ycf2-FtsHi（AtYcf2-FtsHi）和TIC复合物（AtTIC），以及豌豆来源的中间体超复合物（PsTIC-Ycf2-FtsHi）的冷冻电镜结构。
图1 拟南芥叶绿体转入马达AtYcf2-FtsHi的冷冻电镜结构模型
为准确描述AtYcf2-FtsHi复合物的组成和组装模式，研究人员使用来自FtsHi1-TG转基因株系（在FtsHi1后面融合表达一个GFP-3xFLAG标签）的样品，分别确定了其在apo（空载）和ATP-bound 状态下的冷冻电镜结构，整体分辨率分别为3.3和3.2Å。结果不仅验证了七个已报道成分的存在，包括Ycf2、FtsHi1、FtsHi2、FtsHi4、FtsHi5、FtsH12和pdNAD-MDH；还鉴定到四个新的组分，分别命名为AtTam46、AtTam38、AtTam37和AtTam9。
图2 AtYcf2-FtsHi异六聚体马达模块的组装模式
AtYcf2-FtsHi的马达模块各结构域串联在一起，形成三层相互作用界面，分别位于膜间隙区域（IMS）、跨膜区域（TM）和基质侧（stromal side）。在基质区域，六个ATPase结构域和蛋白酶结构域形成两个环，组装成紧密的马达模块。从ATPase结构域一侧观察，马达模块以逆时针顺序组织，成分依次为Ycf2、FtsHi5、FtsHi1、FtsHi2、FtsHi4和FtsH12。有趣的是，马达模块与膜呈一个较大的55°倾斜角度。
图3 AtYcf2-FtsHi马达模块的结构特点
马达模块的ATPase结构域可分为大域（AAAL）和小域（AAAS），Ycf2中AAAL和AAAS之间形成的角度小于其他组分。此外，Ycf2某些关键结构单元缺乏保守性，如拟南芥Ycf2将Walker B的“天冬氨酸-谷氨酸”残基替换为“脯氨酸-天冬酰胺”，精氨酸指（arginine finger）中的一个保守精氨酸残基被丙氨酸取代，ISS（inter-subunit signaling）基序中高度保守的苯丙氨酸被谷氨酸取代。这些结构变化可能会削弱Ycf2结合和水解ATP的能力，阻碍与附件组分的相互作用。
Ycf2的1号孔环明显长于其他马达组件，约50个氨基酸，含许多带负电荷的氨基酸残基，可能有助于招募前体蛋白，该结构特征在各种陆生植物中高度保守。
图4 AtYcf2-FtsHi马达模块中的新鉴定组分
本研究鉴定的四个新组分主要定位于跨膜区域和膜间隙区域。其中，AtTam46是八次跨膜蛋白，形成面向基质侧的中央腔，且有一个脂质分子结合在TM2和TM3形成的凹槽中。AtTam46与相邻的Ycf2和FtsHi5的发夹形螺旋紧密接触，可能有助于稳定马达模块的倾斜角度。
除了AtTam46之外，AtTam38同样能够协助将基质侧的马达部分锚定在叶绿体内膜（IEM）上。具体而言，AtTam38的跨膜螺旋在叶绿体内膜的外小叶侧发生弯曲，形成一个两亲性螺旋，与FtsHi4的跨膜螺旋相相互依附。在基质区域，AtTam38特异性地插入由Ycf2的AAAS结构域、Ycf2的蛋白酶结构域以及FtsH12的AAAL结构域共同形成的空腔之中，这暗示着AtTam38在AtYcf2-FtsHi复合物的组装以及维持马达模块倾斜姿态方面起着关键作用。
AtTam37是类DnaJ（热休克蛋白家族）蛋白，包含两个富含半胱氨酸的锌指结构域。其单股跨膜螺旋与来自FtsHi4、FtsH12和Ycf2的跨膜螺旋共同组装成稳定的四螺旋束，与叶绿体内膜呈倾斜角度且与马达模块平行。另外，AtTam37的可溶结构域与膜间隙区域其他组分紧密接触，进一步促进复合物组装。
最后一种AtTam9 是定位于膜间隙区域的可溶蛋白，它主要与FtsHi5的N端结构域相互作用，很可能有助于复合物的局部组装和稳定性。
图5 豌豆TIC-Ycf2-FtsHi中间体超复合物结构
为全面了解Ycf2-FtsHi与TIC复合物之间的相互作用，研究人员以带有标签的前体蛋白—铁氧还蛋白前体（pre-ferredoxin）为诱饵，捕获包含这两种复合物的超复合物结构。经过数据处理，研究人员成功获得超复合物整体重建模型，分辨率为11.5Å。图像显示Ycf2-FtsHi中pdNAD-MDH以二聚体形式存在，TIC复合物的膜间隙支架有明显裂缝，以及膜的弯曲缩短了两种复合物的空间距离。
综上所述，该研究不仅详细阐述了拟南芥叶绿体Ycf2-FtsHi的组装模型，丰富了对叶绿体转入马达跨物种进化关系的认识；还分离得到豌豆的TIC-Ycf2-FtsHi超复合物，为Ycf2-FtsHi复合物作为叶绿体输入马达的作用提供了令人信服的直接证据，为陆地植物中叶绿体前体蛋白的易位机制提供了有价值的见解。其纯化方法依赖于正在被转运的前体蛋白，可作为一种新策略协助科学家鉴定其他发挥功能的转运系统。
原文链接
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00894-8
供稿 | 黄隽豪
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲
微信号：FRCBS-THU
因扫码入群人员已满，可扫码添加中心官方微信号，管理员邀请入群
精彩回顾
精彩回顾
特别提示
微信公众号又双叒叕更改推送机制了，不是星标的订阅号，收到推送内容的时间会有延迟，甚至根本无法收到最新推送！不想错过FRCBS最新资讯，快来设为星标吧！
方法超简单，只需3秒钟！
点击上方卡片
关注我们吧
THE END
我知道你“在看”哟